β-內酰胺酶單克隆抗體和多克隆抗體的制備（上）
β-內酰胺酶單克隆抗體和多克隆抗體的制備
目前，在我國奶牛養殖業中，青霉素和頭孢菌素等β-內酰胺類抗生素對奶牛乳房炎等疾病的控制起著十分重要的作用。由于一些奶牛養殖商戶濫用抗生素以及未嚴格遵守休藥期，致使牛奶中抗生素殘留超標，乳中殘留的抗生素嚴重危害食品安全和人體健康。我國政府對超過一定限量抗生素的原料乳實施標準控制。國內多數乳品企業對抗生素殘留超標的牛乳采取降價收購或不收購，而一些不法奶站使用一些生物制劑降解牛乳中殘留的抗生素，生產出人造"無抗奶"。
經過調研，初步判斷市售生物制劑的主要成分是β-內酰胺酶，它是由革蘭氏陽性細菌產生和分泌的多種酶組成的酶家族，相對分子質量在28～32ku之間，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內酰胺類抗生素。β-內酰胺酶能夠破壞青霉素內酰胺結構，使其失去活性。該酶的使用掩蓋了牛奶中實際含有的抗生素。崔生輝等人2007年曾在北京零售超市中采集5個廠家生產的、不同種類的牛奶樣品38個，其中63.2%的樣品檢測出β-內酰胺酶。β-內酰胺酶為我國禁用的食品添加劑之一，它可導致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低人們抵抗傳染病的能力，給消費者的身心健康帶來危害。我國于2009年和2011年公布的食品和飼料中非法添加的非食用物質名單中，β-內酰胺酶（金玉蘭酶制劑）兩次上榜，且認定的檢測方法為液相色譜法。
原乳中β-內酰胺酶的檢測方法有微生物杯碟法、快速試劑盒法、液相色譜法和雙流向酶聯免疫法。微生物杯碟法成本低廉。試劑盒法和酶聯免疫法依據抗原抗體特異性反應的基本特性，操作簡單，速度快，特異性好。液相色譜法具有操作時間短、靈敏度高、準確的特點，但所需實驗儀器要求較高。
本研究中制備β-內酰胺酶的多克隆抗體和單克隆抗體，擬通過雙抗夾心法為后續的膠體金免疫層析試紙條的研制奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
實驗動物：日本大耳兔（雌性，兩月齡），北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司；Balb/C小鼠（雌性，SPF級，六周齡）、昆明小鼠（18～22g），購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。
實驗試劑：β-內酰胺酶，Sigma公司；青霉素酶，中國藥品生物制品檢定所；牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉，北京經日今典科技有限公司；單組份TMB顯色液，北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG，北京優博奧生物科技有限公司；HAT、 HT、PEG2000、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司；小鼠SP2/0細胞，本實驗室保存；DMEM低糖培養基，GIBCO公司；小鼠單克隆抗體亞型試劑盒，洛陽賽爾維實驗器材有限公司。
儀器和設備：96孔聚苯乙烯酶標板、細胞培養板，JETBIOFIL公司；酶聯免疫檢測儀、凝膠成像儀，BIO-RAD公司；紫外分光光度計，UNICO公司。
1.2 免疫抗原的選擇
使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析β-內酰胺酶和青霉素酶兩種蛋白的分子質量及純度。分離膠10%，積層膠4%，電泳緩沖液為甘氨酸。
1.3 多克隆抗體的制備
使用β-內酰胺酶對3只日本大耳兔進行免疫。對每只大耳兔，取700μgβ-內酰胺酶，用pH7的0.1mol/LTris-HCL稀釋至 500μL，與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后于兔子背部皮下和兩側腹股溝多點注射。之后的加強免疫使用同劑量免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，背部皮下多點注射，每次免疫間隔兩周。自第3次免疫起，每次免疫4d后于兔子耳緣靜脈采血，分離血清，檢測免疫效果。五免后3d心臟采血，分離血清。
1.4 ELISA篩選方法的建立
1.4.1 包被原濃度的確定采用方陣法，用系列濃度稀釋的青霉素酶橫向包被96孔酶標板，將倍比稀釋的一抗縱向加入，用間接ELISA法確定最佳抗原包被濃度。
1.4.2 包被條件的確定選擇4℃overnight，37℃1h，37℃2h3種方式包被，以確定最佳包被條件。
1.4.3 封閉液的選擇選擇0.2%明膠、5%脫脂奶粉、3%山羊血清、5%小牛血清、0.75%奶粉+2%BSA+5%蔗糖、3%BSA+0.05%吐溫+3%蔗糖、5%奶粉+0.05%吐溫+3%蔗糖7種封閉液封閉，確定最佳封閉液。
1.4.4 封閉時間的優化封閉時間選擇0.5，1，2h，采用間接ELISA確定最佳封閉時間。
1.5 單克隆抗體的制備
1.5.1動物免疫將9只雌性Balb/C小鼠分為3組，高、中和低3個劑量組每次免疫分別為200，100和50μg/只。首次免疫取相應劑量的 β-內酰胺酶，溶于50μl 0.1mol/L Tris-HCL（pH7）中，于等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后小鼠后頸背部多點注射。兩周后使用同劑量免疫原與弗氏不完全佐劑乳化作第2次免疫，于腹腔皮下注射。第
3次免疫后，ELISA法檢測小鼠抗血清的效價。在3組中選取效價最高的小鼠做融合，融合前3d腹腔注射相同劑量的抗原液作加強免疫。
1.5.2 SP2/0骨髓瘤細胞的培養用8-氮雜鳥嘌呤（20μg/mL）處理3代體外培養的SP2/0骨髓瘤細胞，對數生長期時皮下注射Balb/C小鼠背部兩側，每只小鼠注射5×105～1×106個細胞。實體瘤直徑長至2～3cm時，無菌解剖摘取，200目的篩網研磨過濾，重新培養至細胞穩定生長。
1.5.3 細胞融合融合前1d使用昆明鼠培養飼養細胞。取對數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞與免疫小鼠的脾細胞，用50％PEG2000按常規方法融合，使用建立的青霉素酶間接ELISA法檢測培養上清。選擇強陽性孔，用有限稀釋法連續亞克隆4～5次，直至克隆孔100％分泌抗β-內酰胺酶抗體。將建立的穩定、高效價分泌抗β-內酰胺酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株擴增培養，傳3代及凍存復蘇后仍能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，然后置液氮中保存。
1.5.4 腹水抗體的制備采用體內誘生法制備腹水。取Balb/C小鼠腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL/只，兩周后注射抗β-內酰胺酶的雜交瘤細胞5×105個/只，1周后收集小鼠腹腔液。
1.6 抗體的特性分析
使用間接ELISA法對多克隆抗體和腹水中的單克隆抗體效價進行測定，多克隆抗體以空白血清作陰性對照，單克隆抗體以SP2/0骨髓瘤細胞培養上清為陰性對照；采用非競爭酶免疫試驗對單克隆抗體的親和力進行測定；使用亞型鑒定試劑盒對雜交瘤細胞株進行亞型鑒定。采用秋水仙素裂解法對雜交瘤細胞株進行染色體分析。使用Westernblotting對單克隆抗體的分子質量和特異性進行測定。
