怎樣從總rna中進行mrna的分離和純化
真核生物的mRNA分子是單順反子，是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白質歸根到底都是mRNA的翻譯產物，因此，高質量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cDNA文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5?g RNA，理論上認為每克細胞可分離出5～10mg RNA。其中 rRNA為75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA僅占1%～5％，并且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達豐度也不一樣。
真核生物mRNA有特征性的結構，即具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的3’端存在20~300個腺苷酸組成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，這種結構為真核mRNA分子的提取、純化，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。
一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。
目前常用的mRNA的純化方法有：
（1）寡聚（dT）－纖維素柱層析法，即分離mRNA的標準方法；
（2）寡聚（dT）－纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）－纖維素直接加入到總的 RNA溶液中并使mRNA與寡聚（dT）－纖維素結合，離心收集寡聚（dT）－纖維素／mRNA復合物，再用洗脫液分離mRNA，然后離心除去寡聚（dT）－纖維素；
（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。
本實驗應用方法（1）進行mRNA的分離純化。
【試劑與器材】
（一）試劑
1． 0.1mol/L NaOH ，每組200mL
2． 寡聚Oligo（dT）-纖維素
3． 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4． 洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SDS至終濃度。
5． 5 mol/L NaCl，每組10mL
6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL
7． 無RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL
8． 70%乙醇，每組10mL
注意：溶液5，6的配制都應該加0.1% DEPC處理過夜，溶液1，3，4，8則用經0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配制，Tris應選用無RNase的級別。溶液配制后，最好能夠按一次實驗所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實驗只用一份，避免多次操作造成對溶液的污染。
（二）器材
1． 恒溫水浴箱
2． 冷凍高速離心機
3． 紫外分光光度計
4． 巴斯德吸管
5． 玻璃棉
6． 5ml一次性注射器
【操作方法】
（一） oligo(dT)纖維素的預處理
1． 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2． 將懸浮液裝入填有經DEPC水處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
3． 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0。
4． 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩沖液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。
（二） 總RNA濃度的調整
1． 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加熱5 分鐘，然后迅速插在冰上冷卻。
2． 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。
（三） mRNA的分離
1． mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘。
總RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1，2 (mL)洗脫體積(mL)
<0.20.21.01.0
0.2-0.50.51.51.5
0.5-1.01.03.03.0
1.0-2.02.05.05.0
2． 轉移：取1個5ml的一次性注射器，取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，并把它固定在無RNase的支架上，再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉移到注射器，推進塞子直至底部，把含有未結合上的RNA液體排到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。
3． 洗滌：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1，溫和振蕩，充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時準備洗脫。
4． 洗脫：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3倍柱床體積）的洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
5． 測定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脫液組分于4℃，2500g，離心2-3分鐘，上清轉移至新的離心管中，去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。
6． 沉淀：洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-20℃30分鐘或放置過夜。
7． 離心收集：12000g, 4℃離心15分鐘，小心棄去上清，mRNA沉淀此時往往看不見，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃離心5 分鐘，小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
8． 定量：測定OD260和OD280，計算產率以及OD260/OD280的比率（同上一實驗）。
【注意事項與提示】
1． 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。
2． 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質量的先決條件。
3． 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，過量的總RNA，容易造成mRNA不純。
4． RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置于65℃加熱5 分鐘，這一步很重要，其作用（1）破壞mRNA的二級結構，特別是poly(A+)尾處的二級結構，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱后應立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。
5． 應注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴重影響實驗結果。
6． mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb范圍內（如下圖）。一般來說，經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對后續實驗造成很大的影響，如果樣品充足，可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;
Lane 3, 老鼠肝臟mRNA
7． 為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量分裝后保存。另外，如果有低溫冰箱,最好在 -70℃～ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8． 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。
9． 一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。
【實驗安排】
1． 第一天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。
2． 第二天：進行（一）、（二）和（三）1-6。
3． 第三天：進行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。
4． 為了避免由于保存時間過長造成的RNA降解，最好能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。
【實驗報告要求與思考題】
1． mRNA的OD260和OD280值，OD260/OD280比率和計算mRNA產率；
2． mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳結果；
3． 為什么mRNA提取是cDNA合成成敗的關鍵？
附錄：
1．逆轉錄酶及其活性
逆轉錄酶（reversetranscriptase）又稱RNA指導的DNA聚合酶，是以RNA為模板合成DNA的酶。這種酶是1970年美國科學家特明（H.M.Temin）和巴爾的摩（D.Baltimore）分別于動物致癌RNA病毒中發現的，他們以此獲得了1975年度諾貝爾生理學或醫學獎。人們發現，當RNA致癌病毒，如鳥類勞氏肉瘤病毒（Rous sar-coma virus）進入宿主細胞后，其逆轉錄酶先催化合成與病毒RNA互補的DNA單鏈，繼而復制出雙螺旋DNA，并經另一種病毒酶的作用整合到宿主的染色體DNA中，該整合的DNA可能潛伏數個世代不表達，等到適合的條件時被激活，才利用宿主的酶系統轉錄成相應的RNA，其中一部分作為病毒的遺傳物質，另一部分則作為mRNA翻譯成病毒特有的蛋白質。最后，這些RNA和蛋白質被組裝成新的病毒粒子。在這個過程中，遺傳信息流動的方向是從RNA到DNA，正好與轉錄過程相反，故稱反轉錄（reversetranscription，RT）。逆轉錄酶在許多方面與DNA聚合酶相似，含Zn2+，以脫氧核苷三磷酸為底物，從5’到3’合成DNA，反應需要引物。目前已發現不少動物反轉錄病毒，近年來也發現了幾種人類反轉錄病毒，艾滋病毒也是一種反轉錄病毒。
一些生物公司已經提純了逆轉錄酶，生產出了各自的主打產品，比如TAKARA從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶，Invitrogen 從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶, 以及進一步開發的更耐高溫的ThermoScript，Gibco 開發的SuperScripⅡ等，可作為合成某些特定RNA的互補DNA的工具酶，也可用于DNA的序列分析和克隆重組DNA。
AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。因為RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響，良好的逆轉錄效果非常重要。研究表明，ThermoScript比AMV的靈敏性強得多。RT-PCR產物的大小受限于逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長RT-PCR產物的產量。
不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。研究表明，SuperScriptⅡ逆轉錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉錄酶及ThermoScript逆轉錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RNaseH- 的逆轉錄酶同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高于正常的37-42℃的溫度下進行。
2．引物的設計一般遵循的原則：
1）典型的引物20-24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是太長的引物可能會與錯誤配對序列雜交降低了特異性，同時因為 比短序列雜交慢，從而降低了產量。
2）設計5"端和中間區為G或C，且GC含量為50％~60％的引物，以增加引物的穩定性及其與目的序列雜交的穩定性。
3）3"末端盡量不要富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。但因為3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，為了避免3"末端的錯誤配對，所以末端盡量避免為核苷A。
4）在引物對3"末端盡量避免互補序列以免形成引物二聚體，抑制擴增。如果引物序列可能產生內部二級結構會破壞引物退火穩定性，也要盡量避免。
此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5"端而不影響特異性。
有時候，僅有有限的序列信息可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡并引物，同時使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。
為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3"端使用簡并堿基，因為3"端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。
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