PNAS | 單細胞測序新技術揭示了這種有害線粒體DNA突變
線粒體功能下降是衰老和年齡相關疾病的基礎，但線粒體DNA (mtDNA)突變在這些過程中的作用仍然難以捉摸。為了研究mtDNA突變的模式，在單細胞水平上量化mtDNA突變及其相關的致病效應尤為重要。然而，現有的單細胞mtDNA測序方法由于成本高和mtDNA靶率低而效率低下。
2022年12月28日，康奈爾大學顧正龍教授（現就職于復旦大學和粵港澳大灣區精準醫學研究院）團隊（天津工業生物技術所郭曉賢副研究員及康奈爾大學徐偉林博士為該論文的共同第一作者）在PNAS 在線發表題為“High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level”的研究論文，該研究開發了一種具有成本效益的mtDNA靶向測序方案，稱為單細胞多重探針靶向擴增測序(scSTAMP)，并通過實驗驗證了其可靠性。然后，該研究評估了一名76歲女性768個B淋巴細胞和768個單核細胞中的單細胞mtDNA突變。在632個mtDNA覆蓋率超過>100×的B淋巴細胞和617個單核細胞中，結果表明，超過50%的細胞攜帶至少一種mtDNA突變，變異等位基因頻率(VAFs)超過20%，B淋巴細胞和單核細胞平均攜帶這種突變分別為0.658和0.712。
令人驚訝的是，在兩個細胞群中，超過20%的觀察到的突變具有超過90%的VAFs。此外，60%以上的突變發生在蛋白質編碼基因中，其中70%以上為非同義突變，50%以上的非同義突變被預測為高致病性突變。此外，約有80%的突變位點僅在單一細胞中檢測出，表明高頻mtDNA突變在衰老個體的細胞中廣泛存在。總之，該研究結果顯示，具有功能意義的mtDNA突變可能在老年時普遍存在，需要在單細胞水平上進一步研究與年齡相關的mtDNA突變動態。
線粒體通過氧化磷酸化為細胞代謝提供超過90%的ATP，同時在凋亡調控、免疫反應、信號傳導、生物質合成、胞質鈣離子調節等眾多細胞功能中都具有重要作用。作為人體細胞中唯一擁有獨立遺傳體系的細胞器，其遺傳物質線粒體DNA（mtDNA）的變異是很多疾病的導火線，也與衰老密切相關。單個細胞含有成百上千個線粒體，單個線粒體內又可攜帶多個拷貝的mtDNA，因此，單一細胞內的mtDNA突變后經常與野生型mtDNA共存，這種現象被稱為mtDNA異質性。
常見的致病性mtDNA突變多以異質性形式存在，只有在異質性達到某一閾值后才會引發明顯癥狀。傳統的測序技術多以多細胞混合樣品建庫，單個細胞獨有的mtDNA突變因被掩蔽而無法獲得準確地檢測，已有的單細胞測序技術成本較高，且在mtDNA擴增過程中往往伴隨等位基因丟失，難以實現深度mtDNA覆蓋。
為深入認識衰老個體細胞內mtDNA突變的分布及其對細胞功能的影響，研究者首先開發了一種單細胞線粒體全基因組高效特異擴增方法，并基于原創的STAMP(Sequencing by Targeted Amplification of Multiplex Probes)技術進一步研發出低成本的單細胞mtDNA深度測序技術——scSTAMP（單細胞多重探針靶向擴增mtDNA測序）。單細胞一分為二平行測序所獲得的一致性突變頻譜，表明scSTAMP技術在檢測單細胞水平的mtDNA異質性突變中，具有高度的準確性與靈敏性。
線粒體DNA測序揭示單細胞水平存在大量高頻率和功能性mtDNA突變（圖源自PNAS ）
研究者對分選自一位76歲健康女性血液中的B細胞與單核細胞進行大規模單細胞mtDNA測序分析，發現隨機分選的1249個細胞中，超過一半的細胞都攜帶異質性大于20%的mtDNA突變，在所有檢測到的突變位點中，超過20%的異質性頻率甚至高于90%，兩種細胞群體都攜帶高比例(占蛋白編碼基因突變比例高于75%)的錯義異質性mtDNA突變。根據CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)算法，對錯義異質性mtDNA突變的危害進行致病性評分，發現B細胞與單核細胞中分別有52.2%和59.6%的錯義突變評分大于20，表明這些突變具有較高的致病性。此外，約有80%的突變位點僅在單一細胞中檢測出，表明高頻mtDNA突變在衰老個體的細胞中廣泛存在。
總之，該研究不僅為線粒體遺傳模式研究提供了新的方法，同時也揭示了衰老細胞中高頻率和功能性mtDNA突變廣泛存在，提示潛在致病的mtDNA突變有可能促進細胞及個體的衰老。
