單克隆抗體技術(shù)的操作過程
動物免疫
(1) 抗原制備。制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng) 根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時，則必須對抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可以是與 免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。
(2) 免疫動物的選擇。根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來 源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一 般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。
(3) 免疫程序的確定。免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交 瘤的機(jī)會。因此在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個免 疫程序能適用于各種抗原。現(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注 射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強(qiáng)免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細(xì)胞作用更迅速而充分。 在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的結(jié)果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗 體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿 母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。
細(xì)胞融合
首先制備細(xì)胞培養(yǎng)基、 氨基喋呤（A）貯存液、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液等各種細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。然后制備髓瘤細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞融合。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這 種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長 條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。
細(xì)胞篩選
雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測?？贵w檢測的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和 實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報 告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測 方法，并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的“動力學(xué)范圍”，即檢出背景以上的最強(qiáng)與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而 定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細(xì)胞表面微量的蛋白 抗原，檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號，則動力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的 影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測方法來選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測方法。
克隆化
從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn) 行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌 抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克隆），也需要克隆化。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化， 以檢測抗體分泌情況。通常在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行2-3次克隆化，有時還需進(jìn)行多次。所謂克隆化是指使單個細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán) 體的整個培養(yǎng)過程?？寺』姆椒ê芏啵缬邢尴♂尫?、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）分離法。
凍存與復(fù)蘇
（1）雜交瘤細(xì)胞的凍存。在建立雜交瘤細(xì)胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來；另一方面，為了防 止實驗室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災(zāi)難，通常盡可能早地凍存一部分細(xì)胞作為種子，以 免遭到不測。在雜交瘤細(xì)胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時取用。
（2）雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇。雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數(shù)年至數(shù)十年。復(fù)蘇時融解細(xì)胞速度要快，使之迅速通過最易受損的-5℃—0℃，以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胞死亡。
鑒定單抗特性
⑴ 單克隆性的確定 包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。
⑵ 單抗理化特性的鑒定。從實用意義上說，單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項目，它們可為單抗的使用和保存提供重要依據(jù)。
⑶ 單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性測定。單抗與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性決定于它所識別的抗原表位，確定單抗針對的表位在抗原結(jié)構(gòu)上的位置，是單抗特性鑒定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時，進(jìn)一步分析這類表位的差別， 可正確評價單抗的特異性和交叉反應(yīng)性。
