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單靶標or多靶標：新冠檢測試劑該如何選擇？

2021.6.29

目前，國家藥品監督管理局（NMPA）批準的新型冠狀病毒檢測試劑中，大部分采用的方法為實時熒光RT-PCR。它具有簡便快速、特異性強、靈敏度高等特點。那么，其高靈敏度和高特異性的基礎究竟是什么呢？讓我們來一探究竟。

試劑的檢測性能如何體現？

檢測性能評價中最主要的就是靈敏度與特異性。PCR擴增產物以指數方式增加，理論上2-3小時即可將1個靶分子DNA擴增至10億個，因而具有很高的靈敏度。而影響特異性的因素通常有：引物的特異性、堿基配對的正確性以及靶標基因的特異性與保守性。

我們注意到，以上所提到的PCR試劑的靈敏度與特異性都離不開一個叫做“靶標基因”的東西。那什么是“靶標基因”呢？

靶標基因也叫目的基因，是PCR實驗中所要研究的特定基因片段，檢測試劑盒中的引物與熒光探針會與靶標基因發生特異性結合。就此次的新冠病毒而言，由于其與其他病毒如SARS/MERS等具有同源性，如果選擇的靶標基因特異性不足，那么可能會導至假陽性結果。因此，選擇正確且合適的病毒靶標進行引物與探針的設計格外重要，直接影響到試劑的檢測性能。

試劑的靶標基因如何選擇？

結合以上內容我們可以看出，合適的靶標基因應具有強特異性和高保守性。

在病毒序列公布后，國家衛健委印發的最新版《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》，推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區域的引物和探針。

國際上以《加拿大安大略省公共衛生局（PHO）實驗室的指導文件》為例，擴增靶基因包括RdRp基因（ORF1ab基因中的一段）和E基因。

另外以上兩份文件都有說明，在實驗室要確認一個病例為陽性，需用實時RT-PCR方法至少檢測到病毒兩個靶基因（國內添加了對于單個靶標陽性的判讀，若復檢仍為陽性則可判讀為陽性）。

靶標基因對檢測性能的影響

比較分析《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》中的結果：

單靶標(ORF1ab)試劑僅一家，三靶標(ORF1ab、N與E)檢測試劑兩家，主要為雙靶標(ORF1ab與N)檢測試劑；
雙靶標試劑檢出了202010號檢測限濃度(128 copies/mL)陽性樣本，單靶標與三靶標試劑未能檢出；
三靶標檢測試劑的復檢率相對更高；
各試劑對不同靶標基因的靈敏度存在差異，N區的陽性率高于ORF區，樣本陽性越弱，這一現象越顯著。

可以看出，就新冠檢測試劑而言，設計同時針對兩個靶標的引物和探針，可以最大程度的保證特異性并避免漏檢的發生。但靶標基因數如果再多，反過來又會降低檢測的靈敏度。

影響試劑檢測性能的其他因素

就PCR體系而言，不同廠家的檢測試劑盒成分存在差異，引物、探針設計策略等因素都可能會對試劑盒靈敏度、特異性產生較大影響；其次，不同廠家的試劑研發能力參差不齊，若對PCR體系中各種影響因素的把控能力不夠，則會極大程度地影響試劑盒的檢測性能。另外，各實驗室人員的操作能力存在差異，還是以本次新冠病毒檢測的室間質評結果為例，即使是兩家選取了兩個相同靶標基因的試劑，在檢出率和符合率指標上也會有較大差異，以上所說的因素都有可能造成這一結果。

總結

1.單靶標試劑對低病毒載量樣本以及病毒突變株易造成漏檢，三個及以上數量靶標由于PCR體系和結果判讀都更為復雜，導至復檢率高。說明靶標數量并非越多越好，而單靶標也存在明顯不足，雙檢測靶標是更為平衡的選擇。

2.靶標數量并非試劑檢測性能的決定因素，靶標基因的選取、研發過程中對試劑的調試、對實驗影響因素的把控都會造成各廠家試劑的檢測性能參差不齊。對于試劑檢測性能的評估不可局限于單一因素。

參考文獻

1. 陳旭，齊鳳坤，康立，實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用，東北農業大學學報，2010(41)：148-155

2. ?李金明《實時熒光PCR技術（第2版）》，科學出版社

3.?《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第5版)》

4.?《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》

5. 《Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR》

6. 《加拿大安大略省公共衛生局(PHO)實驗室的指導文件》

7.??Jaqueline Goes de Jesus, Claudio Sacchi, Ingra Claro. First report of COVID-19 in South America.

http://virological.org/t/first-report-of-covid-19-in-south-america/409