分子克隆技術(質粒DNA和DNA插入片段的制備、連接反應...-1
克隆（Clone）是指通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體。分子克隆（Molecular Cloning）是指由一個祖先分子復制生成的和祖先分子完全相同的分子群，發生在基因水平上的分子克隆稱基因克隆（DNA克隆）。其基本原理是：將編碼某一多肽或蛋白質的基因（外源基因）組裝到細菌質粒（質粒是細菌染色體外的雙鏈環狀DNA分子）中，再將這種質粒（重組質粒）轉入大腸桿菌體內，這樣重組質粒就隨大腸桿菌的增殖而復制，從而表達出外源基因編碼的相應多肽或蛋白質。由于質粒具有不相容性，即同一類群的不同質粒常不能在同一菌株內穩定共存，當細胞分裂時就會分別進入到不同的子代細胞中，所以來源于一個菌株的質粒是一個分子克隆，而隨質粒復制出的外源基因也就是一個分子克隆。
（一）質粒DNA的制備
質粒是存在于細菌染色體外的能獨立復制的雙鏈閉環DNA分子，它能賦予細菌（宿主細胞）某些特定的遺傳表型。質粒并非細菌生長所必需，但由于其編碼一些對宿主細菌有利的酶類，從而使宿主細菌具有抵抗不利自身生長的因素如抗藥性等的能力。目前發現的質粒主要分為F質粒（性質粒），R質粒（抗藥性質粒），E.coli質粒（大腸桿菌腸毒素質粒）。根據質粒在一個細胞周期內產生拷貝的數量，可將質粒分為嚴緊型（低拷貝，復制1-2次）和松弛型（高拷貝，復制10-200次）。由于質粒的不相容性細菌經分裂后就只留下了拷貝數較高的一種質粒，例如R1和R2兩種抗藥性質粒同屬于一類，由于不相容性使它們不能共存于同一細菌中，但不同類群的質粒可以在一個細菌中共存。
質粒存在于細菌中，所以制備質粒DNA時，首先應將含有質粒的細菌在含有相應抗生素的液體培養基中生長至對數期,使質粒在細菌中得到擴增。
通過離心收集細菌，經堿裂解細菌，使質粒和細菌染色體DNA變性，然后再加中和液，使溶液PH值恢復到中性，這樣質粒DNA又可以復性至天然雙鏈構象狀態，而細菌染色體DNA不能或很難復性所以仍處在變性狀態，這些變性的染色體DNA與變性蛋白質纏繞在一起，易被離心去處，而質粒DNA仍存在于水相中，再用無水乙醇沉質粒DNA，最后經離心即可得到質粒DNA。
（二）DNA插入片段的制備
DNA插入片段是指我們所要研究或應用的基因，也就是將要克隆或表達的基因。獲得DNA插入片段是分子克隆過程中的第一步。目前有幾種方法，如限制性內切酶直接分離法、
文庫篩選法、體外擴增法、人工合成法等，下面以逆轉錄-DNA聚合酶鏈式反應為例介紹獲得外源基因DNA插入片段的方法。
1、逆轉錄反應
所謂逆轉錄，就是以mRNA為模板合成一條互補DNA鏈(即cDNA)的過程，在逆轉錄反應中所用的是逆轉錄酶，即以RNA為模板的DNA聚合酶，它也具有5′-3′DNA聚合酶活性，在合成新的核苷酸鏈時也需要引物。
由于真核基因組DNA由內含子和外顯子組成，內含子不編碼蛋白質，因此體外擴增基因組DNA會給某些研究造成困難，以mRNA為模板的基因擴增可避免這種問題的發生，因此從某種意義上來說，逆轉錄反應更具實用性。
制備cDNA時，首先要從細胞中提取mRNA，以mRNA為模板，在mRNA的poly(A)尾上結合12-18個寡聚（dT）片段作為合成的起始引物，在逆轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈。然后用RNA酶消化DNA-RNA雜交鏈中的RNA，剩下的單鏈DNA的3′端往往有自發回折形成的發夾結構，正好可以作為合成第二條DNA鏈的引物。第二條DNA鏈的合成可以用DNA聚合酶Ⅰ，也可以用逆轉錄酶。雙鏈DNA合成后，用S1核酸酶切去發夾結構，即獲得平端的雙鏈cDNA。
2、DNA聚合酶鏈式反應（PCR）
PCR技術是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核酸存在下，DNA聚合酶催化的一種體外酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。
反應由三個步驟組成：
1、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈DNA解離成單鏈DNA；
2、退火：當溫度突然降低時，使含量遠遠多于模板DNA的引物與模板DNA在局部形成雜交雙鏈；
3、延伸：在4種dNTP底物和Mg2+存在的條件下，DNA聚合酶由5'-3'方向合成新的與模板DNA互補的DNA鏈。以上反應為一個循環，通常進行25-30個循環，由此介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到大量復制，數量可達2×107-8拷貝。
