“鳥槍法(shotgun)”定量蛋白質組學技術
1999年，Yates研究組提出“鳥槍法”(shotgun)，其基本技術路線是針對液體或SDS-PAGE條帶的復雜混合物用酶(Trypsin)酶解成肽段混合物，然后對肽混合物進行多維毛細管液相色譜分離和串聯質譜分析以及數據庫檢索，從而確定蛋白質的種類，可同時鑒定成百上千種蛋白質。他們把這種思路稱為多維蛋白質鑒定技術，即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。與傳統的雙向電泳技術相比具有靈敏度更高，動態檢測范圍更廣等特點。
? ? ? 現在，鳥槍法（Shotgun）蛋白質組學是指使用自下而上（bottom-up）的蛋白質組學技術來研究復雜混合物中的所有蛋白質，如血清、尿液和細胞裂解液等。它結合了高效液相色譜（HPLC）技術和質譜技術（MS）。鳥槍法蛋白質組學的最獨特之處在于，它可以在最小限度分離蛋白質（不再使用二維凝膠電泳獲得分離斑點）的同時，對多種蛋白質進行鑒定和定量。shotgun蛋白質全譜分析的目的在于分析鑒定樣品中盡可能多的蛋白質。Shotgun（鳥槍法）蛋白質全譜分析是利用shotgun技術對蛋白質進行全譜分析，其基本方法是先酶消化混合物中的蛋白質，然后通過液相色譜法（LC）分離得到肽段，接著使用串聯質譜法（MS/MS）鑒定肽段，從而實現蛋白質鑒定。shotgun蛋白質全譜分析允許鑒定樣品的全部蛋白質，可同時鑒定成百上千種蛋白質。
鳥槍法(shotgun)可以分析全細胞裂解樣品和組織抽提物，也可以分析亞細胞分級組分、分離的細胞器等其他亞蛋白質組。如果樣品已經過穩定同位素標記（比如，可用4標、8標、16標等）。根據不同標記的信號強度比例就可以精確確定化學上具有均一性的蛋白在不同樣品中的相對豐度，這種多重分析可以利用在譜圖上產生前后次序的質量標記得以完成。質譜分析以前在樣品中加入同位素標記的某種質量校準肽，通過對此肽的相對定量就可以獲得絕對定量的信息。實現目的肽段的絕對定量，而這一性質可以被充分應用以提供臨床診斷的標準值或閾值。
差異蛋白質的定量研究是基于肽段水平而非完整的蛋白質，成為該技術最大的技術特色，該技術實現了樣品分離與鑒定直接聯合，完全自動化操作，可以用于各種蛋白質混合物的蛋白質組學分析，如血清、組織、各種體液以及尿液等。
技術路線：
鳥槍法的名詞最早來源于基因組測序，指的是先將基因組打斷，分段測序， 然后利用計算機重組在一起。從而確定一段的基因序列。
鳥槍法在蛋白質組研究中的應用方式與此相類似，首先將蛋白質混合物酶解成肽段的混合物， 利用質譜進行分析確定該肽段的氨基酸序列，然后計算機根據設定好的運算法則根據肽段的信息在理論蛋白質數據庫中檢索出這些蛋白質，從而確定該混合物中的蛋白質成分。
shotgun蛋白質組分析法
shotgun更簡潔的一張圖
分析目標：
尋找差異表達蛋白，并分析蛋白功能。
Gene ontology分析
GO數據庫包含了基因參與的生物過程，所處的細胞位置，發揮的分子功能三方面功能信息，并將概念粗細不同的功能概念組織成DAG(有向無環圖)的結構。Gene Ontology是一個使用有控制的詞匯表和嚴格定義的概念關系，以有向無環圖的形式統一表示各物種的基因功能分類體系，從而較全面地概括了基因的功能信息，糾正了傳統功能分類體系中常見的維度混淆問題。在基因表達譜分析中，GO常用于提供基因功能分類標簽和基因功能研究的背景知識。利用GO的知識體系和結構特點，旨在發掘與基因差異表達現象關聯的單個特征基因功能類或多個特征功能類的組合。
對于每一種表達趨勢的基因，選擇性的進gene ontology功能分析。對差異表達的所有基因向gene ontology數據庫的各節點映射。計算每個節點的基因數目，并結合整個數據庫的基因作為背景分部，對于每個節點，得到一個2x2的表格，使用超幾何分布檢驗基因在每個GO節點的富集或貧乏程度。
Pathway enrichment分析
找出差異表達基因在生物學通路中的位置，以闡明其生物學功能以及不同基因之間的相互作用。
1)把差異表達基因定位在生物學通路(Pathway)上。
2)統計分析，確定差異基因可否可以代表某些生物學通路
優點：信息量大，樣本量低，檢測低豐度蛋白更多，相對定量
應用領域：
1)差異蛋白組分析(疾病早期診斷、療效監測)
2)細胞差異性分析(如正義轉染vs空載、目標基因RNAi vs空載)
3)疾病標志檢測(腫瘤標志物，如無血清培養后的分泌蛋白質組)
4)治療檢測(術前vs術后)
5)藥物開發(給藥vs對照)
6)癌癥研究(原位腫瘤細胞系vs轉移)
Shotgun法可以檢測動態范圍10000:1內的低豐度肽段，是目前蛋白質組學研究最主要的技術路線。 現已成功應用于中大規模蛋白質的分離鑒定，不再依賴于雙向凝膠電泳。
因大部分蛋白質在酶解后總有部分肽段是可用質譜鑒定的，因此，多維蛋白質鑒定技術彌補了堿性、疏水蛋白質、相對分子量極大和極小蛋白質在分離和鑒定方法上的不足。
該方法可達到對低豐度蛋白、極端等電點、分子量、完整膜蛋白具有與其他蛋白有相同的靈敏度。 如鳥槍法可鑒定出10個跨膜域以上的膜蛋白，而2DE僅能檢測出2~4個跨膜域的。
Shotgun法可實現自動化、快速、高通量的蛋白組學分析。
但Shotgun法數據冗余復雜，需要專業人員進行分析。
在醫學領域，Shotgun技術可用于以下方面：
除血清血漿外，還可用于研究體液及組織的蛋白組
分泌蛋白組
大腦皮層神經元細胞蛋白組
新生物標記物的發現
疫苗研究，分析感染源的表面蛋白質，從而發現潛在的抗原。如，在分析人類瘧疾致病源plasmodium falciparum時，發現了大量潛在的抗原, 目前這些抗原的特性巳經被評估出來。
發現新的藥靶。如，研究發現甲硫氨酸氨基膚酶是腫瘤生長抑制因子bengmide的分子作用靶點。
部分參考文獻：
1)A proteomics approach to discovering natural products and their biosynthetic pathways, Stefanie B Bumpus, Bradley S Evans, Paul M Thomas, Ioanna Ntai1, Neil L Kelleher, Nature Biotechnology,27,951-956,2009
2)High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes, Paola Picotti, Oliver Rinner, Robert Stallmach, Franziska Dautel, Terry Farrah, Bruno Domon, Holger Wenschuh, Ruedi Aebersold, Nature Methods 7, 43-46 (6 December 2009)
3)Large-scale analysis of the yeast proteome by means of multidimensional protein identification technology, M.P. Washburn, D. Wolters and J. R. YatesNature Biotechnology, 19, 242-247, 2001
4)Comparison of alternativeanalyticaltechniques for the characterisationof thehuman serumproteomein HUPO Plasma ProteomeProject, XiaohaiLi, Xiaohong Qian etc. Proteomics, 5, 3423–3441,2005
5)An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics, Dirk A. Wolters, Michael P. Washburn, and John R. Yates, Anal. Chem., 73 (23), 5683-5690, 2001
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