重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定操作
摘要： 學(xué)習(xí)克隆工作中最常用的雙酶切,將外源基因與質(zhì)粒連接方法及操作技術(shù).
一、實驗?zāi)康模??
1、學(xué)習(xí)克隆工作中最常用的雙酶切；
2、學(xué)習(xí)將外源基因與質(zhì)粒連接方法及操作技術(shù)；
3、學(xué)習(xí)氯化鈣法制備 大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞的技術(shù)；
4、了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義.
5、外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù).
6、學(xué)習(xí)鑒定重組子的方法.
二、實驗原理： ?
重組子的建立：采用雙酶切 質(zhì)粒 載體pBR322和pUC18,酶切后產(chǎn)生了互補(bǔ)的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個質(zhì)粒片段連接.
感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化學(xué)試劑法)的處理后, 細(xì)胞膜 的通透性發(fā)生變化,成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competent cell) .
轉(zhuǎn)化(transformation)：是將異源DNA分子引入一 細(xì)胞株 系,使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù).
電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞.
克隆的篩選：主要用不同 抗生素 基因篩選.常用的 抗生素 有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；
重組質(zhì)粒克隆的鑒定：鑒定帶有重組質(zhì)粒克隆的方法常用的有α-互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法.
最常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析,對于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合α-互補(bǔ)現(xiàn)象來篩選.
三、試劑與器材： ?
1、試劑：pUC18質(zhì)粒,pBR322質(zhì)粒,DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液,DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa),LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ,LB固體培養(yǎng)基,50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲存液,質(zhì)粒快速提取試劑盒(博大泰克),10 X Buffer K, Pst I,EcoR I (TaKaRa)
2、器材：電基因轉(zhuǎn)移議,恒溫?fù)u床,臺式高速離心機(jī),恒溫水浴鍋, 瓊脂糖凝膠電泳裝置,電熱恒溫 培養(yǎng)箱 ,電泳儀,超凈工作臺, 微量移液槍,eppendorf管.
四、操作方法： ?
1、構(gòu)建重組質(zhì)粒
質(zhì)粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,將酶切產(chǎn)物按照1：1的比例混合,使用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒.
2、制備感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞
收集大腸桿菌細(xì)胞,采用CaCl2處理,制備成 感受態(tài)細(xì)胞 .
3、重組子的轉(zhuǎn)化
將構(gòu)建的重組質(zhì)粒加入到制備的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液中,電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中.
4、重組子的篩選鑒定
采用藍(lán)白篩選重組子.酚/氯仿快速抽提質(zhì)粒,酶切后 電泳 鑒定.
五、關(guān)鍵步驟與注意事項：
1、連接反應(yīng)溫度選擇要適中,過高粘末端之間形成氫鍵不穩(wěn)定,過低會影響 連接酶 的活性.
2、連接反應(yīng)兩種質(zhì)粒的比例為1：1,否則容易自連.
3、制備感受態(tài)細(xì)胞時要采用對數(shù)生長期初期的細(xì)胞,低溫處理時間要足夠.
4、電擊法時電擊電壓、電流、時間選擇要合適.
5、轉(zhuǎn)化及藍(lán)白篩選要作陰、陽性對照,防止出現(xiàn)假陽性、假陰性.
六、思考題： ?
1、連接反應(yīng)的溫度選擇的依據(jù)是什么？
2、試分析自己實驗得到的電泳結(jié)果？
3、怎樣保證DNA片段的高回收率和連接的高效率？
4、制備感受態(tài)細(xì)胞的原理是什么？
5、可將外源基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的方法有哪些？
6、通過什么手段可以降低質(zhì)粒自身環(huán)化的數(shù)量？
