RNA探針技術(shù)簡介
許多載體如pBluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經(jīng)標記的NTP，則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點,又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優(yōu)點，主要是： RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產(chǎn)生信號要強。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好。
噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低,因而能在較低濃度放射性底物的存在下,合成高比活性的全長探針。 用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄許多次,所以RNA的產(chǎn)量比單鏈DNA高。并且用來合成RNA的模板能轉(zhuǎn)錄多次，可獲得比單鏈DNA更高產(chǎn)量的RNA。
反應完畢后，用無RNA酶的DNA酶Ⅰ處理,即可除去模板DNA,而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA分離。
另外噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細菌、質(zhì)粒或真核生物的啟動子，對模板的要求也不高,故在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此,當將線性質(zhì)粒和相應的依賴DNA的RNA聚合酶及四種rNTP一起保溫時,所有RNA的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈DNA探針合成中,若模板中混雜其他DNA片段,則會產(chǎn)生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合成的探針是RNA，它對RNase特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA，它有可能帶上質(zhì)粒的序列而降低特異性。
