膠體金標記技術(shù)（制備方法和應(yīng)用）
膠體金標記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物或顯色劑，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標記技術(shù)。由于它不存在內(nèi)源酶干擾及放射性同位素污染等問題，且利用不同顆粒大小的膠體金還可以作雙重甚至多重標記，使定位更加精確。因此已成為繼熒光素、酶、同位素及乳膠標記技術(shù)之后的一種新型標記技術(shù)。現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于電鏡、流式細胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷試劑的制造等領(lǐng)域。
用膠體金作為特殊標記物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等報道了用膠體金標記細胞進行電子顯微鏡的研究。1971
年，Taylor又將膠體金引入電鏡免疫標記技術(shù)中。近年來的研究表明，膠體金也可作為體外免疫加層試驗的指示物。由于膠體金作為標記物具有很多優(yōu)點，因此自其問世以來，在國內(nèi)外的許多研究領(lǐng)域中得到了迅速的發(fā)展。
近年來，它更多的被應(yīng)用于免疫學(xué)和細胞學(xué)相關(guān)分子水平的檢測中。尤其隨著人們物質(zhì)生活的改善，有關(guān)人類健康的問題在現(xiàn)實生活中已顯得非常突出。從 90年代至今的多篇報道都是關(guān)于動物體或人體相關(guān)抗體和病原體檢測的。
一、制備方法
在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界線十分清楚。金顆粒表面帶有大量負電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定的膠體，所以稱其為膠體金。膠體金的制作方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和鞣酸—檸檬酸三鈉還原法。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例（即增加或減少還原劑的量）可得到所需不同直徑的金顆粒。
但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，所以目前常用后兩種方法，以檸檬酸三鈉還原法為例，有兩種方法。
1、Frens標準方法：
（1）取0、01%HAuCl4溶液50mL,加熱煮沸，隨即快速加入1%檸檬酸三鈉溶液0.5mL.
（2）約過25s沸騰的溶液變?yōu)榈{色，大約再過70s，藍色突然轉(zhuǎn)變?yōu)榱良t色，
（3）繼續(xù)煮沸約5分鐘后結(jié)束反應(yīng)。
（4）冷卻后用0.1M K2CO3溶液調(diào)至所需PH值。
（5）此后再延長反應(yīng)時間或另加入額外的檸檬酸三鈉都不影響實驗結(jié)果。
該法制備得到的金顆粒直徑約為41nm，如前所述，要想得到更大或更小的金顆粒，該方法依然可行，唯一不同的是需要改變加入還原劑的量。另外，采用此標準方法所需反應(yīng)時間最短。
2、Slot標準方法：
（1）取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，
（2）再加入2mL1%二水檸檬酸鈉溶液。
（3）將該混合溶液加熱煮沸約15~30min，直至溶液顏色變?yōu)榱良t色，
（4）冷卻后，用0.1M K2CO3溶液調(diào)整PH值，該法制備的金顆粒直徑約為15nm.
膠體金標記蛋白的原理是：在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負電荷，可與蛋白質(zhì)所帶正電荷基團之間產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對所標記蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。
膠體金免疫技術(shù)可大致分為液相膠體金標記技術(shù)和固相膠體金標記技術(shù)，其分類依據(jù)同酶免疫技術(shù)。最早的液相膠體金標記技術(shù)叫免疫金染色法（IGS），它僅以膠體金作為標記物和顯色劑。最初的免疫金染色都采用單標記。即采用大小均一的金顆粒進行標記。后來發(fā)展到可利用不同顆粒大小的膠體金作雙重標記甚至多重標記。但該方法均僅以膠體金顯色，需要較高濃度的標記物，耗費抗體或抗原的量較多，而且需要較大直徑的金顆粒（40-50nm），才能獲得較高的靈敏度，而且當金顆粒過大時，標記物不穩(wěn)定，長期貯存容易發(fā)生自動聚集。
為克服以上缺點，免疫金銀染色法（IGSS）應(yīng)運而生。該方法的原理是，先用膠體金標記物作免疫金染色，再加入含銀的物理顯影液，則銀離子靠電荷吸引，大量吸附于金顆粒周圍，使顯色結(jié)果呈現(xiàn)金屬銀的藍灰色，同時將顯色信號進一步放大。應(yīng)用時，由于本法最終顯色是靠金屬銀的吸附沉積，因此不需要高濃度的膠體金標記物，將膠體金標記物稀釋幾十倍，仍可獲得同免疫金染色一樣的最佳效果。這樣不僅可以節(jié)省大量的抗體或抗原標記物，而且可以節(jié)省大量的膠體金。本方法靈敏度的關(guān)鍵在于膠體金吸附銀顆粒的數(shù)量。小直徑的膠體金比大顆粒膠體金能吸附更多的銀離子，而且小顆粒膠體金比大顆粒膠體金更為穩(wěn)定。所以，在同樣的能見度下，免疫金銀染色法所需的膠體金顆粒更為穩(wěn)定。所以在同樣的能見度下，免疫金銀染色法所需的膠體金顆粒也較小。據(jù)Holgate稱，免疫金銀染色法的靈敏度甚至比Sternberger的PAP法還要高出很多。該方法一度存在的主要問題在于背景染色過高，但1984年，Springgall等通過修改物理顯影操作程序，已基本解決這個問題。固相免疫膠體金標記技術(shù)出現(xiàn)較晚，其原理與液相標記一樣。所不同的只是通過不同的方法最終將膠體金標記物吸附于固相支持物表面，近而進行檢測。
常用的固相免疫膠體金標記技術(shù)有膠體金免疫層析法和膠體金免疫滲濾法。膠體金免疫層析法是根據(jù)層析原理，將膠體金標記的抗原或抗體固定在層析用固相支持物上，通過層析作用，使抗原與抗體專一性結(jié)合。膠體金免疫滲濾法是讓抗原與膠體金標記過的抗體分別濾過有一定孔徑的膜（常用NC膜），在此過程中抗原與抗體專一性結(jié)合，未專一性結(jié)合的抗體濾過膜。兩種方法都最終通過膠體金聚集產(chǎn)生的顏色變化作為結(jié)果判斷的依據(jù)。為了減少膠體金用量，常常通過銀染加強顯色。
二、應(yīng)用
免疫膠體金技術(shù)可以快速，靈敏檢測特定蛋白，這種技術(shù)避免了復(fù)雜的操作，無需特殊檢測儀器，可以適應(yīng)多種檢測環(huán)境，以及多種檢測需要。并且，檢測結(jié)果可以長期保存，便于對照分析。使檢測更具有普遍性。
免疫膠體金標記技術(shù)作為一種日臻完善的檢測技術(shù)，已被廣泛的應(yīng)用于眾多的科研領(lǐng)域中。本實驗采用斑點免疫金—銀染色法（Dot-Immuno- Gold-Silver Straining Method，Dot-IGSS），利用NC膜可以與帶負電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生較強的疏水作用，從而使目標蛋白與NC膜產(chǎn)生較強親和力的特性，以及NC膜易于被封閉的特點，使用NC膜作為固相載體。先使被FMDV免疫過的牛血清（含F(xiàn)MDV抗體蛋白）與NC膜結(jié)合，然后使用合適的封閉液將NC 膜未結(jié)合蛋白的位點封閉，再用膠體金標記過的抗FMDV抗體蛋白的二抗與FMDV免疫過的牛血清作用（利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)），將未特異性結(jié)合的蛋白用PBN溶液和DDW洗脫。最后，利用膠體金可以與銀離子產(chǎn)生電荷吸引，通過銀染加強顯色效果（膠體金本身呈淡紅色，銀染后呈藍黑色），使得可以通過肉眼直接觀察結(jié)果。本方法具有簡便快速，靈敏度高，可直接用肉眼判斷結(jié)果，無須特殊的設(shè)備的優(yōu)點。
