分子雜交技術(shù)的幾種常見的雜交
分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：
(1) Southern雜交:DNA片段經(jīng)電泳分離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。
(2) Northern雜交:RNA片段經(jīng)電泳后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。
根據(jù)雜交所用的方法,另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體可用于雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同商標的尼龍膜需要進行不同的處理，在DNA固定和雜交的過程中要嚴格按生產(chǎn)廠家的說明書來進行。Whatman 541濾紙有很高的濕強度,最早用于篩選細菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點:它更便宜,雜交中更耐用,干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號的強度會明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此,常規(guī)的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。 Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。
(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。
(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。
(5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置。
Southern雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后, Southern雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg與32 P標記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb大小的單拷貝序列。
將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:(1)毛細管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當毛細管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無效時,才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3) 真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號比Southern轉(zhuǎn)移強2-3倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴格時,其背景比毛細轉(zhuǎn)移要高。
1、材料： 待檢測的DNA，已標記好的探針。
2、設(shè)備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA加水至500ml,過濾除菌后于-20℃儲存。
(3)1×BLOTTO:5g脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲于4℃。
(4)預(yù)雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml鮭魚精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)雜交溶液:預(yù)雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
(6)0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
(8)0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris·Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L檸檬酸鈉,用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl體積中酶切10pg-10μg的DNA, 然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24小時(包括DNA分子量標準物)。
(2) 500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30分鐘, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,并輕微搖動: 500ml 0.2mol/L HCl 10分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時間為20分鐘)，用水清洗數(shù)次,傾去溶液; 500ml變性溶液兩次,每次15分鐘,傾去溶液; 500ml中和溶液30分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC液,將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透,再用20×SSC浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過20×SSC液的3濾紙蓋住濾膜,然后加上干的3濾紙和干紙巾,根據(jù)DNA復(fù)雜程度轉(zhuǎn)移2-12小時。當使用尼龍膜雜交時，該膜用水浸潤一次即可，轉(zhuǎn)移時用0.4mol/L NaOH代替20×SSC。簡單的印跡轉(zhuǎn)移2-3小時,對于基因組印跡,一般需要較長時間的轉(zhuǎn)移。
(5) 去除紙巾等,用藍色圓珠筆在濾膜右上角記下轉(zhuǎn)移日期,做好記號,取出濾膜,在2×SSC中洗5分鐘,涼干后在80℃中烘烤2小時。注意在使用尼龍膜雜交時，只能空氣干燥，不得烘烤。
(6) 將濾膜放入含6-10ml預(yù)雜交液的密封小塑料袋中,將預(yù)雜交液加在袋的底部,前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預(yù)雜交3-12小時，棄去預(yù)雜交液。
(7) 制備同位素標記探針（參見第一節(jié)），探針煮沸變性5分鐘。
(8) 在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預(yù)雜交相同溫度下雜交6-12小時。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動: 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。 在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15分鐘, 兩次。
(10) 空氣干燥硝酸纖維素濾膜,然后在X光片上曝光。通常曝光1-2天后可見DNA譜帶。對于≥108 cpm/μg從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg哺乳DNA中檢測到10pg的單拷貝基因。 Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。
1、材料：待檢測的RNA及制備好的探針。
2、設(shè)備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3、試劑：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g檸檬酸鈉，溶于800ml水中，用10mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，定溶到1L。
(2)其他試劑：與Southern雜交試劑類似，只是所有的試劑均應(yīng)用DEPC處理。
4、操作步驟：
(1)RNA經(jīng)變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上。轉(zhuǎn)移方法與轉(zhuǎn)移DNA的方法相似。
(2)轉(zhuǎn)移完畢后 ,以6×SSC溶液于室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小時。
(4) 用下列兩種溶液之一進行預(yù)雜交，時間為1-2小時。若于42℃進行,應(yīng)采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS；若于68℃進行,應(yīng)采用:6×SSC，2×Denhardt's試劑，0.1% SDS，（注意：BLOTTO不能用于Northern雜交）。
(5) 在預(yù)雜交液中加入變性的放射性標記探針,如欲檢測低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應(yīng)大于2×108 cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS于室溫洗膜20分鐘,隨后用0.2×SSC、0.1% SDS于68℃洗膜3次,每次20分鐘。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或與之相當?shù)漠a(chǎn)品)進行放射自顯影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小時。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘,部分水解RNA并提高轉(zhuǎn)移效率。浸泡后用經(jīng)DEPC處理的水淋洗凝膠,并用20×SSC浸泡凝膠45分鐘。然后再轉(zhuǎn)移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛酰RNA,雜交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝膠轉(zhuǎn)移至尼龍膜所用方法，與RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA轉(zhuǎn)移前需用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次,以除去甲醛。當使用尼龍膜雜交時注意，有些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰RNA，同時可部分水解RNA，并提高較長RNA分子(>2.3kb)轉(zhuǎn)移的速度和效率。此外，堿可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰RNA在堿性條件下轉(zhuǎn)移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA轉(zhuǎn)移的方法進行，但轉(zhuǎn)移緩沖液為7.5mmol/LNaOH，轉(zhuǎn)移結(jié)束后(4.5-6.0小時)，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、于室溫晾干。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置于高濃度的堿性溶液中,會導(dǎo)致雜交背景明顯升高,可通過提高預(yù)雜交和雜交步驟中有關(guān)阻斷試劑的量來予以解決。
(6)如用中性緩沖液進行RNA轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移結(jié)束后,將晾干的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2小時,或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優(yōu)先使用,因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經(jīng)此處理后,雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果,務(wù)必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu),而過度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價結(jié)合于尼龍膜表面,導(dǎo)致雜交信號減弱。 對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。
2、設(shè)備：恒溫烤箱，恒溫水浴，臺式高速離心機等。
3、試劑：
(1)LB固體培養(yǎng)基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris·Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris·Cl。
(6)預(yù)洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)預(yù)雜交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。
(8)其余試劑：與Southern雜交相同。
4、操作步驟：
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時,固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標記的探針雜交。
5.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預(yù)雜交1-2小時。
(5) 將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴，以防液體蒸發(fā)。
(6) 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒炓髧栏竦南茨l件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應(yīng)。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。 斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡便、快速、經(jīng)濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。
1、材料：待分析的DNA或RNA樣品，已標記的探針。
2、設(shè)備：狹槽點樣器，真空泵，恒溫水浴，真空烤箱等。
3、試劑：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纖維素濾膜。
（6）濾紙。
4、操作步驟：
(1) 10μl樣品與20μl 100%甲酰胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置于68℃，15分鐘后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH清洗點樣器,再用無菌水充分沖洗。將一張經(jīng)20×SSC浸潤的濾紙鋪在點樣器上,上面再鋪上一張經(jīng)20×SSC浸潤1小時的硝酸纖維素濾膜，加蓋并夾緊，接通真空泵。
(3) 用10×SSC清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合后加樣于孔中。外圍幾個孔中加2μl染料定位,緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗兩次。繼續(xù)抽吸5分鐘,吸干濾膜。
(4) 取出濾膜,夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘干2小時。按上述Southern或Norhtern雜交所述的方法與放射性標記探針雜交。
[注意]
1、在放射自顯影時應(yīng)注意濾膜必須干燥，并覆蓋上保鮮膜，否則，濾膜將與X-光片粘在一起，使以后的操作困難。
2、在雜交過程中，整個濾膜應(yīng)一直是濕潤的，不得干涸。
第三節(jié) 雜交反應(yīng)的條件及參數(shù)的優(yōu)化
不同的反應(yīng)條件對雜交結(jié)果的影響如下：
(1) 根據(jù)雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲酰胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA，并和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預(yù)雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經(jīng)常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質(zhì)會干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據(jù)需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應(yīng)時,連續(xù)的輕微振蕩可獲得較好的雜交結(jié)果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應(yīng)體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導(dǎo)致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根據(jù)探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G·C堿基對的序列比富含A·T堿基對序列的Tm 溫度高。有關(guān)Tm的計算方法，請參考第八章。
(7) 根據(jù)標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。
(8) 在水溶液中雜交時,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時,應(yīng)該用具有更強緩沖能力的6×SSPE。
上述這些條件的改變，對雜交的結(jié)果有不同的影響，應(yīng)根據(jù)研究的具體情況，選用適當?shù)姆椒ā?/p>
