用了這款萬能酶，苯甲醇綠色合成不是事兒
?該研究獲選為ACS Catalysis封面文章。受訪者供圖
化妝品、藥品、化學(xué)品等工業(yè)制備中有一種重要的中間體，就是苯甲醇。傳統(tǒng)上用化學(xué)法生成苯甲醇的工藝過程繁瑣，且會生成大量污染環(huán)境的副產(chǎn)物。
苯甲醇能否實現(xiàn)綠色高效生產(chǎn)？這一直是工業(yè)界和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的問題。
湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室教授李愛濤、陳純琪和郭瑞庭團隊合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了萬能酶——細胞色素P450tol及其復(fù)合體晶體結(jié)構(gòu)，并基于此構(gòu)建了一種活性和穩(wěn)定性均明顯提升的人工融合酶，實現(xiàn)了苯甲醇的高效綠色合成。
北京時間2月14日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表于《美國化學(xué)學(xué)會會刊—·催化》（ACS Catalysis），并被選為封面文章。
萬能酶P450的神奇定向進化
論文通訊作者李愛濤告訴《中國科學(xué)報》，苯甲醇工業(yè)生產(chǎn)采取兩步法，以甲苯為原料，需要用到劇毒的氯氣和強堿氫氧化鈉，才能實現(xiàn)甲苯中惰性C?H鍵的官能團化，制備出苯甲醇。
“C?H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性和較低的化學(xué)反應(yīng)性，因此，C?H鍵官能團化是傳統(tǒng)化學(xué)合成中一個極大的難題，被認為是有機化學(xué)中的一座‘圣杯’?！崩類蹪f。
能不能找到一種辦法，將甲苯綠色高效地轉(zhuǎn)化為苯甲醇呢？
李愛濤和他的團隊想到了酶這種地球上生命中最強大的化學(xué)工具。通過理性設(shè)計和定向進化手段，酶展現(xiàn)出了在生物催化領(lǐng)域的強大功能。
其中，細胞色素P450酶能夠識別多種參與生化反應(yīng)的物質(zhì)（即底物），利用基因工程改造P450酶來量身定制化學(xué)反應(yīng)，成為一個熱門研究方向。2018年諾貝爾化學(xué)獎得主阿諾德教授，就是利用P450酶的定向進化實現(xiàn)了各種特殊的化學(xué)反應(yīng)而獲獎。
在前期研究中，李愛濤從甲苯降解菌中鑒定了一種特殊的P450酶，命名為P450tol。它以甲苯為底物，生成專一的產(chǎn)物苯甲醇。這是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。
然而，P450tol三維結(jié)構(gòu)信息的缺乏，限制了針對P450tol的基礎(chǔ)研究與未來的應(yīng)用。
揭開特殊P450酶的神秘面紗
要改造高效的P450tol，必須揭開酶結(jié)構(gòu)的面紗。
2020年5月，郭瑞庭團隊在世界上首次解析了一種自給自足P450酶的全長晶體結(jié)構(gòu)，獲得了廣泛的關(guān)注。
為此，李愛濤團隊和郭瑞庭團隊展開了合作。“我們非常高興能與李愛濤合作?！惫鹜フf，這次合作解開了P450tol的結(jié)構(gòu)謎團。
在這項研究中，郭瑞庭、陳純琪團隊順利解析了P450tol的空結(jié)構(gòu)以及與底物甲苯及產(chǎn)物苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。通過這些結(jié)構(gòu)信息，精準(zhǔn)的揭示了P450tol由甲苯通過一步反應(yīng)生成苯甲醇且沒有副產(chǎn)物生成的酶結(jié)構(gòu)與催化機制。
陳純琪告訴《中國科學(xué)報》，P450酶的活性區(qū)都會帶一個血紅素分子參與催化反應(yīng)，這次解析的P450tol也不例外。底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個氨基酸（F329和A279）分別位于底物的兩側(cè)，牢牢鉗住了甲苯的苯環(huán)，甲苯前方還有一個氨基酸（V326）負責(zé)固定整個甲苯的位置。
“這樣，催化反應(yīng)發(fā)生時就可以精確的發(fā)生在芐基位，而不是其它任意的位置，如此精巧的反應(yīng)也只有酶可以做到了?！标惣冪髡f。
他們在P450tol與苯甲醇的復(fù)合體結(jié)構(gòu)中看到了類似的現(xiàn)象，只不過苯甲醇的羥基代替甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子。
“我們還觀察到了一個非常有意思的現(xiàn)象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區(qū)完全占據(jù)，還有一些多余的空間，所以我們猜測P450tol或許可以結(jié)合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。”陳純琪說。
進一步實驗結(jié)果與他們推測的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復(fù)合體，且可以精確的在芐基位發(fā)生羥基化反應(yīng)。
所有這些結(jié)果都顯示，底物會以有利于反應(yīng)發(fā)生的方式結(jié)合并參與反應(yīng)，這也使酶的反應(yīng)更精準(zhǔn)而高效。
人工融合酶催化苯甲醇綠色合成
李愛濤告訴記者，自然界中大部分的P450酶都需要一個能夠與之匹配的還原酶來提供電子以發(fā)生催化反應(yīng)，這對于后續(xù)的應(yīng)用是一個難題。
為了實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構(gòu)建高效的自給自足型P450人工融合酶成為科研工作者關(guān)注的焦點。
“2020年5月郭瑞庭團隊解析的自給自足型P450酶（CYP116B46）的全長晶體結(jié)構(gòu)，給我們構(gòu)建自給自足型人工融合酶帶來了非常大的啟發(fā)?！崩類蹪f，他們將P450tol和CYP116B46的還原酶結(jié)構(gòu)域融合，構(gòu)建出一個新的自給自足型人工融合酶。
新的酶不論在酶活性、穩(wěn)定性，還是半衰期方面都獲得了很大的提升，且兩種融合酶具有相似的底物親和力。
“目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報道的穩(wěn)定性和活性均大幅提升的人工融合酶，有很大的希望應(yīng)用于實際的工業(yè)生產(chǎn)中?！崩類蹪f，最近已經(jīng)有企業(yè)向他們伸出了橄欖枝，表示對該項技術(shù)很感興趣，有意向進行下一步研發(fā)或中試。
“不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯，形成羥基化產(chǎn)物，其中有些是非常重要的藥物中間體?！崩類蹪f，基于P450tol的三維結(jié)構(gòu)，他們使用蛋白質(zhì)工程的手段理性設(shè)計和改造，使其反應(yīng)更多的朝向?qū)θ祟愑幸娴姆较虬l(fā)生。
在論文投稿過程中，審稿的三位審稿人指出原來的苯甲醇生產(chǎn)，是利用高污染、多副產(chǎn)物的化學(xué)合成法來完成的，審稿意見中都非常贊同本文利用酶的生物催化來準(zhǔn)確的生成苯甲醇這些的重要化學(xué)品。另外，原來的這個酶要能夠催化酶反應(yīng)，還需要和另一個與之匹配的還原酶來提供電子以進行反應(yīng)，作者們在本篇文章中，構(gòu)建了非常穩(wěn)定的人工融合酶，對于應(yīng)用到未來的綠色生物催化生產(chǎn)制程中，具有非常大的潛力。
“在未來的研究領(lǐng)域，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、人工智能、酶定向進化等的大力發(fā)展，通過理性設(shè)計和改造，獲得更多新的具有重要功能的酶來造福于人類，將會是一個重要的研究和發(fā)展方向，我們也將繼續(xù)致力于更多P450tol人工融合酶的構(gòu)建，期待獲得更具挑戰(zhàn)的新反應(yīng)和性能獲得極大提升的新酶?！惫鹜フf。
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