DNA的克隆過(guò)程概述
DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或受體生物進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)一步研究的分子操作的過(guò)程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術(shù)。DNA克隆涉及一系列的分子生物學(xué)技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細(xì)胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等等。
一 目的DNA片段的獲得
DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內(nèi)的一群DNA分子，這些DNA分子或來(lái)自于目的生物基因組DNA或來(lái)自目的細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈
cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機(jī)械切割和核酸限制性內(nèi)切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學(xué)直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，從基因組DNA
或cDNA中通過(guò)PCR技術(shù)可以獲得目的基因。
二 載體的選擇
基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：1）在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴(kuò)增。2）分子量盡可能小，以利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中也不易被機(jī)械剪切而破壞。
3）載體分子中最好具有兩個(gè)以上的容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因），以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征（如對(duì)抗生素的抗性）。4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn)，為避開(kāi)外源DNA片段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測(cè)表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。
DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質(zhì)粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA
phage
），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達(dá)載體，測(cè)序載體，穿梭載體等。
三 體外重組
體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過(guò)程。大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當(dāng)載體的多克隆位點(diǎn)便可獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通過(guò)T4
DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為粘末端連接。當(dāng)目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。有時(shí)為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有粘末端的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)表達(dá)時(shí)，則要將平端DNA分子通過(guò)一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點(diǎn)等，可以獲得相應(yīng)的粘末端，然后進(jìn)行連接，此為修飾粘末端連接。各種連接策略間的關(guān)系總結(jié)如下：
四 導(dǎo)入受體細(xì)胞
載體DNA分子上具有能被原核宿主細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起始位點(diǎn)，因此可以在原核細(xì)胞如大腸桿菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴(kuò)增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。
將外源重組DNA分子導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞的方法有轉(zhuǎn)化（transformation），轉(zhuǎn)染（transfection），轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。重組質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化技術(shù)可以導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過(guò)轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染效率不高，因此將重組噬菌體
DNA或柯斯質(zhì)粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的導(dǎo)入效率要比轉(zhuǎn)染的導(dǎo)入效率高。
五 重組子的篩選
從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽(yáng)性克隆的過(guò)程就是篩選。目前發(fā)展起來(lái)的成熟篩選方法如下：
（一）插入失活法
外源DNA片段插入到位于篩選標(biāo)記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)造成標(biāo)記基因失活，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變，通過(guò)這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍(lán)白篩選法。
（二）PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆。PCR法篩選出的陽(yáng)性克隆，用限制性內(nèi)切酶酶切法進(jìn)一步鑒定插入片段的大小。
（三）核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針，通過(guò)核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達(dá)蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
（四）免疫學(xué)篩選法
獲得目的基因表達(dá)的蛋白抗體，就可以采用免疫學(xué)篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達(dá)蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達(dá)載體中獲得表達(dá)蛋白的抗體。
上述方法獲得的陽(yáng)性克隆最后要進(jìn)行測(cè)序分析，以最終確認(rèn)目的基因。
