從獲批的11家新冠抗體檢測試劑盒中解析對化學發光法...
從獲批的11家新冠抗體檢測試劑盒中解析對化學發光法的使用
核酸檢測是目前新冠肺炎確診的“金標準”，但核酸檢測也有很大的局限性，例如當前普遍應用的鼻咽拭子采樣有時難以采集到病毒，再加上試劑本身的敏感度問題，核酸檢測可能會出現漏檢。抗體檢測作為新冠肺炎確診的重要輔助方式，可與核酸檢測互相補充驗證以提高診斷的準確率，也可用于篩查無癥狀或輕狀感染者，有助于國家對疫情整體形勢進行判斷和追蹤。美國正準備推動全民新冠病毒抗體檢測行動，篩選產生新冠病毒抗體的人，以便評估現有防疫措施的效果，并為精細化隔離及復工等決策提供參考。
目前國內新冠疫情防控形勢逐漸好轉，但海外疫情仍在持續惡化，短期內海外市場對抗體檢測試劑盒的需求激增，海外不斷拋來的訂單讓國內具有出口資質的試劑盒公司忙于擴大產能，加班加點地趕工生產。近日，又有2家公司的新冠病毒抗體檢測試劑盒獲得國家藥監局的批準，搶到了進軍海外市場的入場券。截止目前，國家藥監局已應急批準9家企業共11個新冠抗體檢測試劑盒產品（表1）。
表1 國家藥監局批準新冠病毒抗體檢測試劑盒清單
在國家藥監局批準的抗體檢測試劑盒中，有6種產品利用膠體金法，5種產品使用化學發光法。膠體金的優勢是使用方便快速，成本低，應用范圍廣，技術難度系數相對較低，但存在靈敏度低、無法定量等局限?；瘜W發光檢測的靈敏度高，不僅可顯著提高臨床檢測的準確性，還具備高通量、簡便安全、速度快等特點。小編之前已介紹過膠體金法（文尾可查看前文），今天小編就帶大家了解下化學發光法是怎么一回事。
目前藥監局批準的化學發光試劑盒的檢測原理是將新冠病毒抗原蛋白包被在微粒上，抗原蛋白將結合新冠肺炎患者血清中的IgG/IgM，隨后加入化學標記的人IgG/IgM二抗，經過清洗去除游離態的化學標記物后再加入發光底物產生化學發光，通過測量光信號完成對血清中IgG/IgM的定性或定量檢測（圖1）。
那么目前用化學發光法檢測新冠病毒抗體的效果到底怎么樣呢？小編通過介紹一篇研究論文來帶領各位看官一探究竟。
2020年3月27日，廣東省組織器官區域免疫與疾病重點實驗室的研究人員在預印本平臺bioRxiv上發表論文"Evaluations
of serological test in the diagnosis of 2019 novel coronavirus
(SARS-CoV-2) infections during the COVID-19
outbreak"，對應用化學發光法進行新冠病毒抗體檢測的靈敏度和特異性進行了研究，文章內容如下：
研究人員首先對化學發光試劑盒進行組裝。他們利用原核表達系統重組表達出新冠病毒的全長核衣殼蛋白（Nucleocapsid
Protein,
以下簡稱N蛋白），將N蛋白與磁微粒進行偶聯，用于捕獲血清中的特異性抗體。同時他們對抗人IgG、IgM的抗體進行化學標記，用于檢測血清中的IgG和IgM。
研究人員收集到79位新冠確診患者的血清作為實驗組，同時收集29位健康人員和51位結核病患者的血清作為對照組。利用化學發光試劑盒檢測實驗組和對照組的血清，研究人員發現實驗組血清IgM檢測信號的平均強度為對照組的6-8倍，而IgG的平均信號強度則為對照組的60-70倍，說明IgG的檢測信號更強（圖2）。
圖2 對照組及實驗組血清的IgM和IgG檢測信號強度
研究人員以IgG和IgM的平均信號強度為基準線，發現在檢測血清中IgG時，實驗組中有65例的檢測信號為陽性，對照組中有2例信號為陽性，說明IgG的檢測靈敏度和特異性分別為82.28% （65/79）和97.5%（2/80）；IgM的檢測靈敏度同樣為82.28%（65/79），但特異性僅為81.25%（15/80），明顯低于檢測IgG的97.5%（表2）。
因為IgG和IgM的檢測特異性差別較大，研究人員對兩種檢測方案與新冠確診患者的性別、年齡和發病天數的關系進行了研究，他們發現確診患者的性別和發病天數對IgG和IgM的檢測結果無明顯影響，但發現18歲以下的確診患者其IgG和IgM的陽性檢出率明顯低于18歲以上的確診患者（表3、4）。
研究人員從上述血清樣本中取出65例實驗組樣本和64例對照組樣本，對化學發光法和國產商業化ELISA試劑盒的檢測效果進行了比較。兩種方法的IgM檢測假陽性率都為21%，而IgG檢測假陽性率則較低；化學發光法的IgM和IgG檢測的靈敏度都明顯高于ELISA試劑盒，說明化學發光法的實際檢測效果更好（表 5）。
表5 化學發光法與ELISA試劑盒用于檢測新冠病毒抗體的效果比較
文章結論：在新冠病毒抗體檢測中，化學發光法的實際檢測效果好于ELISA試劑盒，并且使用化學發光法檢測IgG的靈敏度和特異性都較高，可用于臨床輔助診斷新冠肺炎。
由于這篇論文的臨床樣本數量較小，論文的實驗結果和結論還有待于更大規模樣本研究的確認。此外因為新冠疫情萬分緊急，很多商業化的新冠抗體檢測試劑盒還未進行嚴格的臨床實驗來驗證檢測效果，且試劑盒生產廠商為了趕進度，產品的質量和批間差也難以保障，因此這篇論文中化學發光法和ELISA試劑盒的檢測效果差異也需要更全面的實驗設計來驗證。
N蛋白是新冠病毒中重要的結構蛋白，常作為新型冠狀病毒抗體檢測的抗原工具。這篇論文中的化學發光檢測試劑盒使用的抗原蛋白即為N蛋白，保證了此試劑盒具有較好的靈敏度和特異性。據小編所知，目前市場上的商業化新冠抗體檢測試劑盒（膠體金法和化學發光法）中，大多數使用的抗原蛋白也都是N蛋白。由此可見，N蛋白是新冠抗體檢測試劑的核心原料，其重組表達的純度和活性對檢測試劑的實際使用效果具有重要影響。
ACROBiosystems開發了His標簽以及生物素標記的新冠病毒N蛋白，并驗證了N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結合活性，靈敏度能達到0.02 ng/mL，可用于不同類型試劑盒的開發中。
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不同類型N蛋白的活性驗證
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SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag (C-terminus）
貨號：NUN-C5227
N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結合靈敏度為活性驗證0.02 ng/mL
Immobilized
SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His Tag (Cat. No.?NUN-C5227) at 2
μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27)
with a linear range of 0.02-0.6 ng/mL.
SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag (N-terminus）
貨號：NUN-C51H9
N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結合靈敏度為活性驗證0.02 ng/mL
Immobilized
SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His Tag (Cat. No.?NUN-C51H9) at 2
μg/mL (100 μL/well) can bind SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27)
with a linear range of 0.02-0.3 ng/mL.
Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His,Avitag?
貨號：NUN-C81Q6
生物素標記N蛋白與Anti-N蛋白抗體的結合靈敏度為活性驗證0.4 ng/mL
Immobilized
SARS-CoV-2 NP Antibody, Rabbit MAb (CLN27) at 2 μg/mL (100 μL/well) can
bind Biotinylated SARS-CoV-2 Nucleocapsid protein, His,Avitag (Cat.
No.?NUN-C81Q6) with a linear range of 0.4-3 ng/mL.
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N蛋白產品列表
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貨號 ? ?種屬 ? ?產品名稱 ? ?
NUN-C51H9 ? ?SARS-CoV-2 ? ?SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag ? ?
NUN-C5227 ? ?SARS-CoV-2 ? ?SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His Tag ? ?
NUN-C81Q6 ? ?SARS-CoV-2 ? ?Biotinylated SARS-CoV-2 (COVID-19) Nucleocapsid protein, His,Avitag? ? ?
NUN-M51H5 ? ?MERS ? ?MERS Nucleocapsid protein, His Tag ? ?
NUN-S5148 ? ?SARS ? ?SARS Nucleocapsid protein, His Tag ? ?
