大腸桿菌雜交及基因定位
一、原理
大腸桿菌染色體呈環(huán)狀。高頻重組菌株（Hfr）的染色體上整合有F因子，當Hfr細菌與F－細菌細胞發(fā)生接合（即雜交）時Hfr細胞（供體菌）的染色體從Hfr細胞向F－細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。由于染色體的轉(zhuǎn)移具有一定的方向性，并且可以隨時中斷，因此根據(jù)結(jié)合后F－細菌（以重組子形式選出）中Hfr細菌染色體基因出現(xiàn)次數(shù)的多少，即可得知基因轉(zhuǎn)移的先后順序，也就是說基因在染色體上排列的順序。轉(zhuǎn)移時，靠近轉(zhuǎn)移起始點的染色體基因進入F－細胞的機率大，重組頻率高，遠離轉(zhuǎn)移起始點的基因進入F－細胞的機會少，重組率低，F(xiàn)因子大部分位于轉(zhuǎn)移起始點相對的一端（末端）。因此轉(zhuǎn)移的頻率很低。只有當接合時間很長，足以使整個染色體轉(zhuǎn)入F－細胞（受體）時，才會使F－細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镠fr或F＋狀態(tài)。
基因定位時首先要從Hfr與F－細菌的混合培養(yǎng)物中篩選出某一Hfr與F－細菌基因（選擇性標記基因）已經(jīng)發(fā)生了重組的細菌（重組子），然后在這些重組子中逐個測定其它的Hfr基因（非選擇標記）出現(xiàn)的次數(shù)。Hfr菌株染色體上的選擇性標記應(yīng)位于染色體前端，這樣才能保證以100％的頻率出現(xiàn)在重組子中。選擇性標記之后的基因，則以低于100％的頻率出現(xiàn)在重組子中。F－細胞的選擇性標記應(yīng)起到排除Hfr菌生長的作用（即反選擇）。本實驗使用的F－菌株為Strr,
Hfr菌為Strs,借此可排除Hfr菌的生長。另一方面為保證Hfr基因有機會出現(xiàn)在重組子中，反選擇性標記應(yīng)位于染色體后端。為了使Hfr菌株有較高的接合頻率，F(xiàn)－細菌應(yīng)該過量以保證每一個Hfr細菌都能與F－細菌接合（10～20：1）。
二、目的
通過本實驗，了解大腸桿菌雜交及其基因在染色體上的排列方式，并掌握大腸桿菌接合及染色體基因定位的原理與方法。
三、材料、試劑與器具
1、受體菌：FD1004 F－leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT strr rifr。
2、供體菌：CSH60 Hfr sup strs。
3、生理鹽水：0.85%NaCl。
4、10×A緩中液。
5、基本培養(yǎng)基。
6、LB培養(yǎng)基。
7、選擇培養(yǎng)基[B]—[G]：基本培養(yǎng)基加氨基酸（表1－2）。
8、培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管、滅菌牙簽、搖床、酒精燈、接種環(huán)。
四、操作步驟
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1、第一天傍晚，分別接一環(huán)供體菌和受體菌于5ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)10－12小時。
2、第二天清晨，各取1ml過夜培養(yǎng)物，分別加入到2個盛有5ml LB培養(yǎng)液的250ml三角瓶，37℃振蕩培養(yǎng)2－3小時。
3、吸取0.5ml供體菌和4.5ml受體菌，加入到一個無菌的250ml三角瓶中混合，置37℃搖床上培養(yǎng)100分鐘。
4、將上述接合菌液用生理鹽水稀釋100、10-1、10-2倍。
5、各吸取0.1ml稀釋液涂布在選擇培養(yǎng)基[A]平板上，每一種稀釋液涂布2個平板。同時將供體菌及受體菌分別吸取0.1ml涂布在[A]上作對照，每種各2個平板。此后均于37℃條件下培養(yǎng)48小時。
6、第四天，1）觀察和計數(shù)選擇培養(yǎng)基[A]平板上接合組和對照組的菌落生長狀況；2）在與平皿相同大小的白紙上畫100個小格，將圓片貼于選擇培養(yǎng)基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然后用滅菌牙簽從接合組選擇培養(yǎng)基[A]平板上隨機挑選100個菌落，對號點種在選擇培養(yǎng)基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100個小格中；3）將所有平板置于37℃箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。
7、第六天，統(tǒng)計在各種選擇平板上生長菌落的數(shù)目，記錄于表1－1中。并繪制出基因順序圖。
表1－1 各選擇培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目統(tǒng)計
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| 重復(fù)次數(shù) |
[B] ? arg |
[C] ? trp |
[D] ? his |
[E] ? lac |
[F] ? gal |
[G] ? rif |
| 1 | ||||||
| 2 | ||||||
| 3 | ||||||
| 4 | ||||||
| 5 | ||||||
| 6 | ||||||
| 總數(shù) | ||||||
| 平均數(shù) | ||||||
| 重組率* |
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表1－2 選擇性培養(yǎng)基附加成份表
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培養(yǎng)基 ? 編號 |
選擇性 ? 標記 |
基本 ? 碳源 |
基本培養(yǎng)基（A）中補充物質(zhì) | ||||||||
| str | rif | arg | ilv | met | leu | ade | trp | his | |||
| A | Met leu str | 葡萄糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| B | (met leu str)arg | 葡萄糖 | ＋ | － | － | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| C | (met leu str)trp | 葡萄糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | － | ＋ |
| D | (met leu str)his | 葡萄糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | － |
| E | (met leu str)lac | 乳糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| F | (met leu str)gal | 半乳糖 | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
| G | (met leu str)rif | 葡萄糖 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | ＋ | ＋ |
